شکل و ابعاد مولکولی پلیمر ها و روش های اندازه گیری

در این مطلب که ترجمه ی فصل سوم کتاب Polymers In Natural از Greenwood و McGREGOOR  هست، با مفاهیم شکل مولکولی پلیمرها و روش های تعیین وزن مولکولی و شکل آنها آشنا میشویم. برای مشاهده کامل تصاویر لطفا فایل پی دی اف را دانلود کنید. برای خواندن مطلب، روی ادامه مطالب کلیک کنید.

دانلود

 فصل سوم:

شکل و ابعاد مولکولی

مترجم: بردیا ایراجیان

3-1- مقدمه:

برای شناسایی کامل یک پلیمر، باید وزن مولکولی آن تعیین شود. مولکول های پلیمر با سایز معینی وجود ندارد، بلکه به صورت ی از وزن مولکولی نمونه مشاهده میشود.

در این فصل درباره چند روش مهم برای سنجش وزن و شکل مولکول های پلیمر صحبت میکنیم.

بیشتر روش های سنجش وزنی بر پایه بررسی محلول های پلیمری است و بنابراین به حلالی مناسب نیز احتیاج داریم. حلالی "خوب" نامیده میشود که برهمکنش مناسبی بین پلیمر و حلال ایجاد کند، در حالیکه در حلال "بد" بر همکنش بین پلیمر با پلیمر مناسب تر است. در حلال های خوب، حتی در غلظت کم، حجم مولکول پلیمر اشغال کننده انقدر بالاست که میتوان فرض کرد برهمکنش مولکولی اتفاق می افتد. بنابراین محلول های پلیمری به صورت ایده آل (بر آمده از قانون)، حتی در غلظت های پایین، پیروی نمی کنند. رفتار گفته شده در حلال های بد کمتر مشاهده میشود. تئوری هایی که برای سنجش وزن مولکولی وجود دارند، بر اساس محلول های ایده آل توسعه یافته اند، بنابراین وقتی با محلول های پلیمری با غلظت سر و کار داریم، استفاده از چندین غلظت ضرورت دارد تا نتیجه را با برونیابی به حالت رقت بینهایت برسانیم.

علاوه بر مشکلات حاصل از ایده آل نبودن، مشکلات دیگری ناشی از تجمع مولکول های پلیمر یا تفکیک آن ها به اجزای کوچک تر نیز وجود دارد. هر از چند بررسی این پدیده ها صرف نظر شده و بهتر است از حلالی استفاده کنیم تا این اثرات را تا حد امکان به حداقل برساند. در مواردی خاص از مشتق سازی پلیمر برای از بین بردن مشکلات ذاتی آن استفاده میشود. اگر باز هم پلیمر ناپایدار بود باید حلالی پیدا کنیم که درشت مولکول ها حداقل در مدت زمان اندازه گیری در آن پایدار بمانند.

وضعیت در صورت استفاده از پلیمرهای باردار پیچیده تر میشود. (محلول های پلی الکترولیت به صورت مشخضی از حالت ایده آل انحرفا دارند.) بنابراین روند اندازه گیری زمان طولانی تری نیاز دارد. بنابراین روند شناسایی این ترکیب در محلول با قدرت یونی بالا- که توصیف کننده تفکیک یونی درشت مولکولهاست- انجام شده و سپس به قدرت یونی صفر، برونیابی میشود.

هر روش معرفی شده در این فصل تنها برای یک بازه مشخص جرم مولکولی کاربرد دارد، همچنین تمام روش ها به صورت جهانی گسترش پیدا نکرده و وزن مولکولی با ابزار های در دسترس سنجیده میشود.

از آنجایی که نمونه شامل یک گستره ی وزن مولکولی است، هر روش جرم را به صورت میانگین اندازه گیری میکند. تفاوت وزن های میانگین مولکول ها بسته به روش اندازه گیری دارد. بنابراین با توجه به تنوع وزن های مولکولی ارتباط آن ها باهم اهمیت دارد.

3-2-وزن مولکولی میانگین:

وقتی اندازه های مولکولی یک نمونه یکسان نباشد، توزیع وزن مولکولی داریم. نمونه ای را شامل n₁ مولکول با وزن M₁، n₂ با وزن M₂ و... n_i مولکول با وزن M_i باشد، در نظر بگیرید و بر اساس آن وزن های مولکولی میانگین را تعریف میکنیم.

میانگین حسابی وزن یک مولکولی معین به عنوان متوسط عددی وزن میانگین شناخته میشود. ( ) که با معادله ی زیر معرفی میشود:

3-1                             

این میانگین با استفاده از روش هایی که به تعداد مولکول های حاضر وابسته است، اندازه گیری میشود. این میانگین به صورت یکسان تحت اثر مولکول های سبک و سنگین است.

در روش های دیگر اندازه گیری وزن مولکولی، هر ذره با مشخصه وزنی خود معرفی میشود. متوسط وزنی وزن مولکولی یا  بر این اساس تعریف میشود.

3-2                             

این میانگین بیشتر تحت تاثیر مولکول های سنگین تر است تا مولکول های سبک تر. دو مثال را در نظر بگیرید:

مثال الف) برای یک نمونه پلیمری که 50% آن را جرم مولکولی 10000 و 50% را 100000 تشکیل میدهد داریم:

و

به طور مشخصی  از بزرگ تر است. به صورت کلی برای یک پلیمر با گستره ی وزن مولکولی  از بزرگ تر بوده و نمونه پلی دیسپرس است. اگر ابعاد همه مولکول ها برابر باشد Mn=Mw و نمونه مونودیسپرس است. نسبت    به عنوان شاخص پلی دیسپرسیتی معرفی میشود. اگر  آنگاه نمونه مونودیسپرس است و اگر آنگاه نمونه پلی دیسپرس است و یک توزیع وزن مولکولی دارد. به صورت کلی هر چه مقدار  بیشتر باشد گستره ی وزن مولکولی نیز بیشتر است.

مثال ب)  یک نمونه پلیمری شامل 50% با وزن مولکولی 10000، 40% با وزن 100000 و 10% با وزن 1000000 است.

در مثال ابف نسبت  برابر 1.67 بود در حالیکه در مثال ب 4.43 است. در مثال دوم  نسبت به  بیشتر تحت تاثیر مولکول با وزن بیشتر است. بنابراین نسبت  افزایش پیدا کرده و نشان دهنده ی گستره ی بزرگ تری از وزن های مولکولی است.

باید این نکته را یاد آور شد که اگر از دو روش که دو میانگین متفاوت را اندازه میگیرند (مثل  و ) استفاده کنیم، مقادیر میانگین متفاوت اند و این ناشی از خطای روش های اندازه گیری نیست، بلکه بهتر است با این مقادیر پلی دیسپرسیتی نمونه سنجیده شود.

همچنین میتوان دو نمونه با ترکیب های متفاوت اما  و  یکسان داشت.

مثال پ) 56.7% مولکول های یک پلیمر وزن 20000 و 11.9% وزن 50000 و 31.4% شامل وزن 120000 است.

این توزیع، که با توزیع مثال اول متفاوت است، مقادیر  و  بسیار نزدیکی با مثال اول میدهد. (این مثال ها ساختگی است و برای نشان دادن این مشخصات آورده شده است: در طبیعت توزیع وزن به صورت غیر پیوسته امکان پذیر نیست.)

در عمل تنها مقادیر  و  برای تعیین پلی دیسپرسیتی کافی نیست و توزیع کامل وزن مولکولی باید اندازه گیری شود.

دو وزن میانگین دیگر نیز وجود دارد. یکی از آنها از اندازه گیری های ویسکوزینه (بخش 3-3-4) بدست آمده و متوسط ویسکوزیتی به صورت زیر بیان میشود:

3-3                                                     

مقدار a به شکل پلیمر در محلول مرتبط است. اگر a=1 آنگاه

یک میانگین دیگر متوسط Z وزن مولکولی است ( ) که اثر مولکول ها با وزن بالاتر را پررنگ تر میکند. این متوسط که از ابرساتریفیوژ کردن بدست می آید (قسمت 3-3-3) به صورت زیر معرفی میشود:

3-4                                                     

3-3- روش های اندازه گیری وزن مولکولی

3-3-1- روش های مبتنی بر خواص تجمعی (کولیگاتیو)

خواص کولیگاتیو یک ماده خواصی هستند که به تعداد ذرات حل شده ارتباط دارند و نه با ماهیت طبیعی آن ها.( در شرایط ایده آل) بنابراین متوسط عددی وزن مولکولی با اندازه گیری این خواص مشخض میشود.

وزن مولکولی الیگومر ها و مولکول های کوچک (وزن مولکولی کمتر از 20000) با استفاده از اسمومتر فشار بخار اندازه گیری میشود. این روش بر مبنای کاهش فشار بخار ناشی از حضور ذرات حل شده کار میکند.

بخش اساسی دستگاه اندازه گیری (که به صورت تجاری موجود است.) یک جعبه دقیق ترموستاتی است که از دو ترمیستور تشکیل شده است. (مقاومت های حساس به گرما) که بخش اصلی یک پل ویتسون (Wheatstone) است. جعبه با بخار حلال اشباع میشود، یک قطره از حلال روی هر ترمیستور ریخته میشود و پل ویتسون متعادل میشود. یکی از قطره های حلال با محلول جایگزین میشود. چون فشار بخار محلول کمتر است حلال روی قطره محلول، مایع میشود. گرمای میعان آزاد شده و قطره را گرم میکند. دما تا زمانی که فشار بخار قطره ی محلول گرم با فشار بخار حلال در دستگاه برابر شود، افزایش پیدا میکند. تغییر مقاومت ترمیستور در تماس با محلول اندازه گیری میشود.

برای محلول های ایده آل تغییر مقاومت متناسب با غلظت مولی حل شونده است. در واقعیت این غلظت نمیتواند با تغییر مقاومت اندازه گیری شود، زیرا بخشی از گرما از دستگاه از دست میرود. سیستم توسط ماده ای با جرم مولکولی مشخص کالیبره میشود. بنابراین تغییر مقاومت ناشی از تغییر غلظت مولی مشخص قابل اندازه گیری است. با این داده ها جرم مولکولی ماده مجهول قابل تعیین است.

به صورت ایده آل، تغییر در مقاومت ( ) میتواند با جرم مولکولی ماده حل شده (M) متناسب باشد.

3-5                                                                                         

که در آن  K ثابت کالیبراسیون و c غلظت حل شونده است. محلول های پلیمری تابعیت ضعیفی از حالت ایده آل داشته و ارتباط اختلاف مقاومت با غلظت توسط معادله ی دقیق تری به صورت زیر اندازه گیری میشود:

3-6                                                     

بنابراین یک سری اندازه گیری برای  با کمک مقادیر مختلف c باید اندازه گیری شود و نمودار تغییر  با c را نشان میدهد. برونیابی نمودار تا c=0 مقدار  را نشان میدهد و M قابل محاسبه است.

وزن های مولکولی بزرگ تر تا 1000000 را میتوان با فشار اسمزی محلول پلیمر اندازه گرفت. اگر یک غشای نیمه تراوا (غشایی که اجازه عبور مولکول هاب حلال را میدهد ولی مولکول های درشت پلیمر نمیتوانند عبور کنند) محلول پلیمری را از حلال خالص جدا کند، تمایلی برای عبور مولکول های حلال از غشا و وارد شدن به محلول ایجاد میشود. از این جریان میتواند با اعمال فشار به محلول، جلوگیری کرد و این فشار را به عنوان فشار اسمزی سیستم اندازه گرفت. هر چند میتوان بدون حضور فشار خارجی به سیستم اجازه داد تا به تعادل برسد، حلال با ورود به محلول باعث ایجاد یک فشار هیدرواستاتیک در بالای محلول میشود که در حالت تعادل مانع از ورود حلال به محلول میشود. (شکل 3-1) اگر محلول در حد مناسبی از رقت باشد، فشار هیدرواستاتیک میتواند به عنوان فشار اسمزی معرفی شود. (π) روش دوم طولانی تر است اما از دقت بیشتری دارد.

میزان کیفیت اسمومتری به قدرت نیمه تراوایی غشا مرتبط است. در تئوری غشا نباید اجازه عبور مولکول های پلیمر را بدهد، در حالیکه مولکول های حلال باید آزادانه حرکت کنند. فیلم های سلولزی و مشتقات آن عموما به عنوان غشا استفاده میشوند. با انتخاب درست غشا میتوان اندازه گیری را هم در آب و هم در حلال غیر آبی انجام داد. به خاطر دشواری در پیدا کردن غشایی که نسبت به مولکول های کوچک پلیمر ناتراوا باشد، این روش برای مولکولهایی با جرم بیشتر از 20000 مناسب است.

شکل 3-1:

شمای یک اسمومتر الف) در آغاز ب) در حالت تعادل

از آنجا که اسمومتری به تعداد ذرات حل شده ارتباط دارد (مثل غلظت مولی)، وزن بدست آمده از این روش از نوع متوسط عددی وزن مولکولی است. ساخت محلولی مناسب برای سنجش از مولکول های بسیار بزرگ که سخت حل میشوند، دشوار است.(غلظت در حدود 10^-5M) بنابراین با افزایش وزن سنجش نیز سخت تر میشود. بنابراین حد بالایی اسمومتری حدود 1000000 است.

در هنگام کار با نمونه بسیار پلی دیسپرس باید دقت بیشتری کرد تا جرم کوچکترین مولکول و بزرگترین مولکولی در بازه گفته شده قرار گیرد. در غیر اینصورت اندازه گیری با خطا همراه است.

برای یک محلول ایده آل فشار اسمزی به صورت زیر بدست می آید:

3-7                                                                             

که در ان R ثابت جهانی گاز ها، T دما برحسب کلوین، V₀ حجم مولی حلال و x کسر مولی حل شونده است. برای محلول های بسیار رقیق میتوان از معادله وانت هوف استفاده کرد:

یا

3-8                                                                                                                 

که در آن c غلظت حل شونده بر حسب g/L و M جرم مولی حل شونده است. هر چند در غلظت های مناسب محلول پلیمری برای اندازه گیری، برهکنش بین مولکولی سبب رفتار غیر ایده آل میشود. معادله بهتر برای فشار اسمزی به این صورت بیان میشود:

3-9                                                                             

که در آن  و  ضرایب ویریال هستند. در غلظت های پایین (کمتر از 0.3%) ضریب قابل صرف نظر است:

3-10                                                                                       

با برون یابی  در غلظت c=0 به  میرسیم. بنابراین برای اندازه گیری به چندین غلظت نیاز داریم تا نمودار  بر حسب c رسم شود و  بدست می آید. این حد نهایی با حالت ایده آل برابر قرار داده میشود:

3-11                                                                                                   

وقتی از پلیمرهای باردار، مثل پلی الکترولیت ها، استفاده میکنیم، نیاز به تمهیدات بیشتری داریم. به خاطر اثر دونان (Donnan)، جزیی غیر مساوی از یون های کوچک از غشا عبور میکنند. اگر محلول شامل پلیمری با بار مثبت باشد، در سمت حلال، ذرات منفی بیشتر از ذرات مثبت سمت غشا هستند. این اتفاق سبب وابستگی بیشتر  به c میشود. اگر از محیط با قدرت یونی بالا استفاده کنیم، تفکیک یونی پلیمر کمتر شده و اثرات گفته شده به حداقل مقدار خود میرسد.

اسمومتری برای اندازه گیری بسیاری از مولکولی های طبیعی مثل پروتئین ها، پلی ساکارید ها، رابرها استفاده میشود. همچنین تجهیزات به صورت تجاری موجودند. مورد دوم از مبدل برای اندازه گیری فشار اسمزی مشاهده شده استفاده میشود.

3-3-2- اندازه گیری تفرق نور:

محلول درشت مولکول ها بر اساس اندازه، شکل و غلظت پرتو نور را میشکند. با اندازه گیری شدت نور شکسته شده توسط محلول پلیمری، میتوان جرم مولکولی و شکل را تعیین کرد. (شکل 3-2) اگر پلیمر بزرگ تر باشد اندازه گیری راحت تر است چون مولکول های بزرگ تر نور را نسبت به مولکول های کوچکتر، بیشتر میشکنند، برای مثال مولکولهایی با وزن 10⁸ با استفاده از تفرق نور به راحتی شناسایی میشود. در نمونه های پلی دیسپرس این روش مقدار متوسط وزنی وزن مولکولی را میدهد.

برای اندازه گیری میتوان از محلول های آبی یا غیر آبی استفاده کرد، اما مشکل اصلی ساخت نمونه ی بدون گرد و خاک است. خاک معمولا با فیلتر کردن یا اولتراسانتریفیوژ محلول پلیمری جدا میشود، زیر وجود گرد و خاک موجب ایجاد خطا میشود.

نور شکسته شده توسط ذره در زاویه θ به صورت کمی با R_θ به صورت زیر بیان میشود:

3-12                                                                           

که در آن I_θ شدت نور شکسته شده و I₀ شدت نور تابیده شده و r فاصله دستگاه اندازه گیری از محلول است.

شکل 3-2: دیاگرام دستگاه تفرق نور

برای محلول های ایده آل کوچک مولکول ها داریم:

3-13                                                                                                   

که در آن K ثابت، c غلظت حل شونده با جرم M است. ( که در آن n₀ ضریب شکست محلول، با استفاده از نوری با طول موج ₀λ و N₀ عدد آووگادرو است. dn/dc تغییرات ضریب شکست با غلظت را نشان میدهد.)

متاسفانه محلول های پلیمری رفتار ایده آلی نداشته و مقدار  به غلظت وابسته است. همچنین وقتی مولکول های پلیمر درشت باشند (در حدود طول موج نور تابیده شده) قسمت های مخحتلف مولکول نور را به شکل های متفاوتی پخش میکند. نور پراکنده شده از یک انتهای مولکول میتواند با نور پخش شده از انتهای دیگر تداخل کند و شدت نور پراکنده شده را کاهش دهد. (شکل 3-3) این اثر سیی کاهش وابستگی شکل و اندازه ی پلیمر میشود. از این رو فاکتور تفرق ذارت، P_θ، به صورت زیر تعریف میشود:

P_θ تابعی از sin²(θ/2) است. برای محلول های غیر ایده آل پلیمری در غلظت های پایین داریم:

3-14                                                                                       

که B ضریب ویریال است.

برونیابی  تا غلظت صفر مقدار  را میدهد.اگر شکل مولکول مشخص باشد P_θ بدست آمده و M حساب میشود. در بسیاری از موارد شکل مولکولی مشخص نیست. خوشبختانه برای θ=0 برای تمامی شکل های پلیمری P_θ=0 است. بنابراین M با دوبار برونیابی تا غلظت و زاویه ی تفرق صفر بدست می آید. این برونیابی منحنی زیم نامیده میشود و در شکل 3-4 نشان داده شده است. از برخورد خط c=0 و =0θ مقدار M (یا برای نمونه های پلی دیسپرس ) بدست می آید. همچنین میتوان تخمینی از اندازه ی مولکول در محلول بدست اورد. شیب خط با غلظت صفر متناسب با مربع شعاع ژیراسیون است. (شیب برابر  است که R_G² مربع شعاع ژیراسیون است. به قسمت 3-5 رجوع شود.)

شکل 3-3- برهمکنش نور با پلیمر هنگامی که اندازه پلیمر در حدود طول موج نور تابشی است. نور از موضع A و B پخش شده تا فواصل متفاوتی را طی میکنند تا به P_forward برسند.همچنین مسیر نور برای رسیدن به P_forward و P_backward متفاوت است.

شکل 3-4- منحنی زیم، دوبار برونیابی تا داده های تفرق نور تا بدست آوردن وزن مولکولی. ● داده های تجربی و ◦ داده های حاصل از برون یابی. K یک ثابت دلخواه در نظر گرفته میشود. Sin²(θ/2)≈kc؛  در متن تشریح شده است.

 وزن مولکولی بسیاری از پلیمر های طبیعی مثل پلی ساکارید ها، پروتئین ها، لیگنین و نوکلئیک اسید ها از این روش بدست می آید. اگر از دئوکسی ریبونوکلئیک اسید بزرگ (با ورن مولکول بالا تر از 6×10⁶) استفاده شود،  تابعی خطی از  نبوده و برون یابی منجر به بدست آمدن جرم بسیار کمتری از مقدار واقعی میشود. با توسعه دستگاه هایی که میتوانند تفرق نور را در زاویه های کمی بررسی کنند، بسیاری از مشکلات حل شده است.

تفرق نور روشی مناسب برای بررسی تغییرات جرم مولکولی در گذر زمان است. مشاهده پیوسته نتایج شدت تفرق میتواند وابستگی درجه پلیمریزاسیون، گسستن یا پیوستن پلیمر با زمان را نشان دهد.

اخیر تجهیزات تفرق نور با لیزر هم فراهم شده است. این اصلاح امکان سنجش نمونه پلیمری با حجم کمتر در زاویه کمتر را فراهم میکند. (تهیه ی نمونه کوچک تر عاری از گرد و خاک راحت تر است.) بنابراین برونیابی های کمتری تا رسیدن به زاویه ی صفر نیاز است. همچنین استفاده از منبع لیزر امکان آنالیز نوسانات غلظت موضعی پلمیر را میدهد. این داده ها برای تعیین ضریب نفوذ پلیمر مناسب است. (قسمت 3-3-3-1)

3-3-3-اولترا سانتریفیوژ

اولتراسانتریفیئژ به بیان ساده سانتریفیوژ با سرعت بالا، در حدود 60000 دور بر دقیقه، است. این سرعت سبب ایجاد یک میدان نیرویی به مقدار 250000g میشود. در این میدان ذرات پلیمری در راستای میدان نیرو حرکت کرده یا ته نشین میشود. (شکل 3-5 الف و ب) رفتار یک درشت مولکول در چنین میدان نیرویی اطلاعاتی در مورد هموژنیتی، جرم مولکولی و توزیع وزن مولکولی میدهد. به صورت کلی اولتراسانتریفیوژ میتواند جرم از چند هزار تا چندین میلیون را تعیین کند.

سودبرگ (Svedberg) دانشمندی سوئدی بود که این روش را توسعه داد. اون به خاطر کارهایش با این روش و تعیین طبیعت مولکولی، هموژنیتی مولکول و جرم مولکولی پروتئین ها، برنده ی جایزه نوبل شیمی شد.

در شکل 3-6، شمای کلی یک دستگاه تجاری اولتراسانتریفیوژ نشان داده شده است. نور عبور کننده از هر سلول میتواند برای بررسی تغییرات غلظت حل شوند در سلول مورد استفاده قرار گیرد. سه نوع سیستم متفاوت نوری در این روش استفاده میشود: جذبی، تداخلی و شیلرن. با کمک سیستم جذبی، از یک منبع نور فرابنفش استفاده میشود. با کمک یک اسکنر فوتوالکتریک، میزان جذب نمونه با حلال خالض مقایسه میشود. اسکنر میتواند مستقیم به یک ثبت کننده، که تغییرات غلظت در سلول را  را دنبال میکند، متصل شود. (شکل 3-5-ج) این سیستم برای شناسایی نولکئیک اسید ها و پروتئین ها در غلظت کم مناسب است. (میتوان از محلول چند میلی گرم پلیمر در چند میلی لیتر محلول استفاده کرد.) نور مرئی معمولا برای سیستم تداخلی استفاده میشود. نور از حلال و محلول عبور کرده تا تداخل کرده و الگوهای تداخلی ایجاد کند. (شکل 3-5-د) حساسیت سیتم های جذبی کمتر است اما اندازه گیری های کمی، دقت بالاتری دارد. در این روش، تعداد الگوهای غیر افقی، متناسب با غلظت حل شونده است. سیستم شیلرن، الگویی مرتبط با تغییرات غلظت در طول سلول میدهد، برای مثال منحنی مشتق غلظت بر حسب فاصله. (شکل 3-5-ه) این روش نیز حساسیت کمتری دارد، اما برای اندازه گیری سرعت ته نشینی (پایین را ببینید) و هموژنیتی بسیار مناسب است.

شکل 3-5- اثر میدان نیرویی قوی روی یک نمونه پلیمری در یک سلول اولترا سانتریفیوژ الف) آغاز، ب) گذشت زمان کمی، ج) جذب نور در زمان متناسب با تصویر ب، د) الگوی تداخلی متناسب با ب و ج، هـ) الگوی شلیرین (Schlieren) متناسب با ب، ج و د، و) الگوی شیلرن برای سیستم دوتایی پلیمر

شکل 3-6-شمای یک دستگاه الکتریکی اولتراسانتریفیوژ که از سیستم شیلرن استفاده میکند.

3-3-3-1-سرعت ته نشینی:

وقتی مولکول های پلیمر ته نشین میشوند، حلال از ان ها جدا شده و لایه ای مشخص بین حلال و پلیمر ایجاد میشود. (شکل 3-5) تغییرات مرز را میتوان با صفحه فوتوگرافی، اسکن فوتوالکتریک در طی مدت سانتریفیوژ، در زمان های مختلف ثبت کرد.این سرعت ته نشینی با جرم مولکولی پلیمر متناسب است.

ضریب ته نشینی، S، به صورت سرعت کلی حرکت مولکول در جهت میدان نیرو، dx/dt، تعریف میشود. برای مثال سرعت مرز حلال و محلول بر واحد میدان نیرو. X فاصله از محور چرخش است و داریم:

3-15                                                                                                   

که ω سرعت چرخش زاویه ای است. ضریب ته نشینی در بازه 1-200×10^-13 ثانیه است و هر 10^-13 ثانیه، به افتحار گسترش دهنده ی این روش، یک سودبرگ (S) نامیده میشود. بنابراین بازه شریب ته نشینی بین 1 تا 200  S است.

ضریب ته نشینی طبف معادله ی سودبرگ میتواند به جرم مولکولی (M) مرتبط شود.

3-16                                                                                       

که در آن R ثابت جهانی گازها، T دما برحسب کلوین و D ضریب نفوذ پلیمر، V حجم ویژه جزئی پلیمر، و ρ چگالی حلال است. (سرعت نفوذ مولکولی از مرز مشخص حلال-محلول، متناسب با گرادیان غلظت (dc/dx) و سطح مقطع (A) مخزن است. اگر جرم مبادله شده به ازای واحد زمانی dm/dt باشد، ضریب نفوذ طبق قانون اول فیک  بدست می آید.)

در غلظت های پایین (که قابلیت استفاده از سیستم های جذبی را دارند.) ضریب ته نشینی به غلظت پلیمر وابسته است. به صورت کلی اگر محلول پلیمر رقیق باشد، در هم تنیدگای کاهش یافته و سرعت ته نشینی زیاد میشود. مقدار S با توجه به معادله سودبرگ برای محلول در حد رقت، S₀، میتوان بدست آید. این مقدار معمولا با رسم نمودار 1/S برحسب c بدست می آید. خط راست حاصل تا c=0 برونیابی شده و 1/S₀ بدست می آید. (اگرچه استفاده از سیستم های جذبی و غلظت کم پروتئین یا نولکئیک اسید مقدار نزدیک به S₀  به صورت مستفیم از این مولکول های زیستی بدست می آید.)

ضریب ته نشینی میتواند با استفاده از گرادیان موضعی چگالی (قسمت 2-3-3-1) بدست آید. هرچند اصلاحاتی باید برای چگالی و ویسکوزیته حلال و تغییرات جزیی حجم مخصوص پلیمر، صورت گیرد. به صورت کلی ضرایب ته نشیتی در حالت استاندار، مثلا حلال آب 25 درجه، موجود است.

برای پلیمر پلی دیسپرس جرم مولکولی میانگینی که از این روش بدست می آید، به عنوان میانگین در نظر گرفته نمیشود. نه Mn است و نه Mw. اما به شکل مولکولی ارتباط دارد.

قبل از تعیین وزن با کمک ته نشینی مقادیر V و D باید مشخص باشند. سختی اصلی استفاده از معادله سودبرگ، تعیین ضریب نفوذ است.

از چگالی محلول مشخص باشد، غلظت پلیمر به صورت دقیق تعیین شده حجم مخصوص جزیی پلیمر به راحتی بدست می آید. چگالی به راحتی، برای مثال با کمک موقعیت قطره محلول آبی، تعیین میشود. قطره آبی در یک مایع آلی غیر قابل حل در آب که با گرادیان چگالی کالیبره شده، معلق میشود. ( ، که ρ چگالی حلال،  تغییر چگالی محلول با غلظت پلیمر است که تا حد رقت برون یابی میشود.) حجم مخصوص جزیی پروتئین ها با مشخص بودن آمینو اسید های آن تعیین میشود.(قسمت 4-3-2)

روش های متعددی برای تعیین D یا ضریب نفوذ پلیمر وجود دارد. با به کار بردن فوتومتر های تفرق نور لیزر ضریب نفوذ با کمک مقدار بسیار کم محلول بدست می آید. روش قدیمی تعیین D، بر مبنای تغییرات غلظت با زمان در مرز مشخص حلال و محلول است. برای چنین سیستمی داریم  که در آن C₀ غلظت اصلی محلول است. حداکثر مقدار  است. بنابراین D با کمک C0 و حداکثر dc/dx در هر زمانی بدست می آید. مقدار D برای استفاده در معادله سود برگ، باید با اندازه گیری ضریب نفوذ باید با اندازه گیری ضریب نفوذ در تعدادی از غلظت ها وبرون یابی تا حد رقت بدست آید.

سرعت ته نشینی میتواند برای تعیین جرم مولکولی پروتئین ها، پلی ساکارید ها و نوکلئیک اسید ها به کار رود. همچنین ضرایب ته نشینی میتواند برای تعیین یک نوع ریبونوکلئیک اسید از دیگر به کار رود. (فصل 5)

3-3-3-2- تعادل ته نشینی

در اینجا میدان نیرویی ضعیف تری نسبت به بررسی سرعت ته نشینی داریم. سرعت چرخنده به گونه ای است که حرکت پلیمر در جهت میدان نیرو با نفوذ مولکولی که در جهت عکس رخ میدهد کاملا مساوی و برابر است.

3-17                                                                           

تغییرات c با x² در یک سلول قابل دنبال کردن است. V و ρ مشخص بوده و M بدست می آید. یک مزیت این روش عدم نیاز به D برای تعیین جرم مولکولی است. هر چند این روش به زمان زیادی نیاز دارد، برای مثال ممکن است چند روز برای رسیدن به تعادل زمان لازم باشد.

یک روش دیگر که قبلا مطرح شده است، M در غلظت های اولیه ی مختلف اندازه گیری شده و مقدار حقیقی M با برونیابی تا حد رقت بدست میآید. برای یک پلیمر پلی دیسپرس متوسط وزنی وزن مولکولی با این روش بدست می آید.

اگر از حجم کمتری محلول در سلول اولتراسانریفیوژ استفاده کنیم، به مقادیر کمتری از پلیمر نیاز داریم. سیستم نوری حضور ستون کوتاهی از مایع، در حد چند میلی متر، را نشان میدهد. معادله 3-17 به فرم انتگرال گیری شده به صورت زیر میتواند مورد استفاده قرار گیرد:

3-18                                                                           

که در آن زیروند b و m به ترتیب به قاعده (base) سلول و هلاله ی محلول (meniscus) اشاره میکنند. به خاطر وجود گرادیان غلظت در سلول، Cm صفر نیست.

برای یک نمونه پلی دیسپرس متوسط وزنی وزن مولکولی نمونه داخل سلول را میدهد. از معادله 3-17 وزن مولکولی میتواند با توجه به موقعیت مشخص هر مولکول پیدا شود و از آن متوسط Z وزن مولکولی بدست می آید (قسمت 3-2):

3-19                                                               

که Mw جرم مولکولی بدست آمده از معادله 3-17 است. زیروند b و m به قاعده و هلاله ی محلول اشاره میکنند. اندازه گیری دقیق cm دشوار است. یفانتیس (Yphantis) روشی بهبود یافته برای این کار معرفی کرد. سرعت چرخش بسیار زیاد شده و بنابراین غلظت در هلاله و چند میلیمتر پایین تر از آن صفر میشود. با وجود نقطه ای که در آن c=0 است، بیان غلظت در هر نقطه از سلول ساده تر است. با بکار بردن روش یوانتیس و دانستن توابع مختلف بین c و x، برای پلیمرهایی که بازه جرم مولکولی آن ها بسیار باریک است، متوسط عددی، متوسط وزنی و متوسط Z در هر نقطه از سلول (با وجود نقطه ی C=0) بدست می آید. به علاوه متوسط وزنی و متوسط Z در کل سلول قابل محاسبه است.

دوباره مقادیر باید در غلظت های اولیه مختلف اندازه گیری شود و تا حد رقت بی نهایت برون یابی شود. برای نتایج بهتر اندازه گیری ها باید در سرعت های مختلف چرخش نیز انجام شود و تا سرعت صفر برونیابی شود. اثر سرعت بیشتر با درهم تنیدگی پلیمرها که بر تغییر فشار اثر گذار است، مشخص میشود. به صورت کلی با افزایش سرعت، فشار وارد بر قاعده (کف) سلول نیز افزایش می یابد.

روش یفانتیس به صورت گسترده برای تعیین جرم مولکولی پروتئین ها و نولکئیک اسید ها استفاده میشود. از آنجا که مقادیر بدست آمده بسیار نسبت به آلودگی های کوچک مولکول ها در هلاله، حساس است باید دقت زیادی به کار برد.

اندازه گیری ورن مولکولی پلیمرها میتواند با گرادیان چگالی ته نشینی تعادلی در نمک مثل سزیم کلرید (بخش 2-3-3-2) صورت گیرد. در تعادل، نوار پلیمری بسته به اینکه کجا معلق باشد، چگالی درشت مولکول با چگالی محلول برابر است. برای پلیمر منودیسپرس، جرم مولکولی مشاهده شده با توزیع غلظت در نوار مرتبط است:

3-20                                       

که در آن x0 فاصله وسط نوار از محور چرخش و dρ/dx گرادیان چگالی در سلول است. دوباره سری مقادیر M_app در غلظت های مختلف باید تا رقت بینهایت برونیابی شود.

استفاده از این روش برای نوکلئیک اسید ها با دشواری هایی همراه است. زیرا تنوع مولکول های سازنده نوکلئیک اسید ها کم بوده و نوارها گستره هستند. (نیروی ارشمیدسی نوکلئیک اسید ها به صورت بحرانی با با ساختار مولکولی آنها ارتباط دارد.) این گستردگی نوارها سبب ایجاد خطا در وزن مولکولی میشود. این نوار گسترده، به دلیل ناهمگونی ، مقدار نادرستی برای وزن مولکولی می دهد. بعلاوه ، در مورد مولکولهای نوکلئیک اسید مشکلات بسیار بزرگی ایجاد میکند، زیرا ممکن است توسط نیروهای برشی درون سلول اولتراسانتریفیوژ تخریب شود.

در گذشته از روش سوم استفاده از اولتراسانتریفیوژ برای اندازه گیری وزن مولکولی استفاده میشد، اما این روش با توجه به مصرف زیاد پلیمر امروزه استفاده نمیشود. این تکنیک یک روش شبه تعادل بود که توسط Archibald ابداع شد و نیازی به ایجاد یک تعادل حقیقی نداشت. مشخص شد که میزان جابجایی مولکولها در سراسر سلول از هلال و قاعده باید در هر زمانی صفر باشد. (به عبارت دیگر، در هلاله و پایه ی سلول، حرکت نفوذی به خاطر نیروی گریز از مرکز متعادل میشود.) از این حالت، معادلاتی ایجاد شده است تا وزن مولکولی را از اندازه گیری های نزدیک هلاله و پایه سلول بدست آوریم. این روش برایا ندازه گیری وزن پروتئین ها و پلی ساکارید ها استفاده میشود.

در تمام مواردی که از اولتراسانتریفوژ استفاده می شود، غلظت نمک در محلول های پلیمری باید به اندازه کافی بالا باشد تا از یونیزاسیون پلیمر جلوگیری کند. اگر خود پلیمر باردار باشد، تئوری های تعیین وزن مولکولی بسیار پیچیده می شوند.

3-3-4-ویسکومتری

اندازه گیری ویسکوزیته محلول های پلیمری روشی آسان و سریع برای تعیین وزن مولکولی در محدوده 10⁴ تا 10⁶ است. اگرچه با این روش نمیتوان به صورت مستقیم جرم مولکولی را بدست آورد و ابتدا باید با استفاده از اجزای پلیمری با جرم معین که شبیه پلیمر مورد بررسی است، کالیبره شود. این مورد برای کالیبراسیون یک نقطه ضعف روش است. مقدار پلیمر مورد نیاز زیاد است، (در حدود چندین هزار میلیگرم) که این خود ضعف دیگری است.

اضافه کردن یک پلیمر به یک حلال باعث افزایش ویسکوزیته مایع می شود. این روش بر این مبنا کار میکند.  این افزایش به اندازه و شکل ماکرومولکول ها مربوط می شود.

اگر ₀η ویسکوزیته حلال در دمای مورد آزمایش و η ویسکوزیته محلول باشد پلیمری با غلظت c (برحسب گرم بر میلی لیتر) در همان دما باشد، ویسکوزیته ویژه (η_sp) از رابطه زیر بدست می آید:

3-21                                                                                                   

به طور کلی، ویسکوزیته ویژه با غلظت رابطه ی زیر را دارد:

3-22                                                                                       

که در آن k’ ثابت و [η] ویسکوزیته باطنی است. این مقدار را می توان با اندازه گیری  در غلظت های مختلف و برونیابی تا غلظت صفر بدست آورد.

برای یک سری از اجزا (از یک نوع پلیمر) که دارای جرم های مولکولی متفاوتی اند، رابطه ای به شکل زیر وجود دارد:

3-23                                                                                                               

که K و a هر دو ثوابتی اند که به حلال ، دما و ماهیت پلیمر بستگی دارند. a همچنین به شکل پلیمر موجود در محلول مربوط می شود. بنابراین برای یک سری از جزها با وزن مولکولی مشخص ، یک نمودار از log[η] باید در برابر logM خطی باشد ، و K و a به ترتیب می توان از عرض از مبدا و شیب تعیین کرد. وزن مولکولی اجزا ها ابتدا باید با روشی مستقل از قبیل اسمومتری یا تفرق نور تعیین شود، اما پس از تعیین K و a ، می توان وزن مولکولی یک نمونه ناشناخته را مستقیماً از عدد ویسکوزیته باطنی آن [η] بدست آورد.

اگر نمونه پلی دیسپرس باشد ، وزن مولکولی به طور متوسط ویسکوزیته، ، بدست می آید (به بخش 3.2 مراجعه شود.) مقدار a معمولاً بین 0 و 1 است و بنابراین، متوسط ویسکوزیته بین متوسط عددی،  و متوسط وزنی وزن مولکولی  قرار دارد. هنگامی که a = 1 ،  است. برای بسیاری از پروتئین های کروی ، a = 0 ، و ویسکوزیته باطنی تقریبا مستقل از M  است بنابراین اندازه گیری ویسکوزیته نمی تواند برای تعیین وزن مولکولی این نوع پروتئین ها به کار رود. مگر اینکه ابتدا ساختار سه بعدی پروتئین از بین برود.

ویسکوزیته ها را می توان با مقایسه زمان جریان یک محلول پلیمری از طریق یک لوله مویین با زمان عبور حلال خالص مورد مطالعه قرار داد. زمان، t، لازم برای گردش مایعات بین دو علامت اندازه گیری می شود (شکل 3.7 را ببینید). بعد از این رابطه پیروی میکند:

3-24-الف                                                                                            

که در آن A’’ و B’’ ثابت است که با استفاده از کالیبراسیون با مایع ویسکوزیته تعیین میشود و ρ چگالی محلول است. با طراحی دقیق ویسکومتر ، جمله دوم B’’ρ/t قابل اغماض است. (این جمله انرژی از دست رفته هنگام ورود و خروج از لوله مویین را تامین میکند.) معادله 3-24-a به صورت زیر ساده میشود:

3-24-ب                                                                                                          

و ویسکوزیته ویژه از معادله 3-21 به جمله زیر تبدیل میشود:

3-25-الف                                                                                

که در آن ρ₀ چگالی حلال است و زمان جریان حلال t₀ است.

برای محلول های پلیمری رقیق ρ=ρ₀، و بنابراین داریم:

3-25-ب                                                                                              

بنابراین ویسکوزیته های ویژه می توانند به طور مستقیم از زمان جریان محاسبه شوند. در ویسکومتر نشان داده شده در شکل 3.7، می توان رقیق سازی را مستقیم در ویسکومتر انجام داد، به طوری که  را می توان در تعدادی از غلظت ها اندازه گیری کرد، که برای برون یابی  تا رقت بی نهایت لازم است.

هنگامی که ویسکوزیته باطنی [η]  بسیار زیاد باشد ، محلول های پلیمری ممکن است ویسکوزیته های مختلفی در اثر اعمال نیروهای برشی مختلف نشان دهد. در چنین مواردی، ویسکوزیته ها باید در نیروهای برشی مختلف اندازه گیری شوند. سپس تا نیروی برشی صفر برونیابی شوند. نیروهای برشی مختلف را می توان با استفاده از ویسکومتر با لوله مویینی هایی که قطرهای مختلفی دارند و یا یک ویسکومتر استوانه مخصوص به دست آورد.

پلیمرهایی که پلی الکترولیت هستند باید در محلول هایی با غلظت نسبتاً زیاد نمک مورد بررسی قرار گیرند تا از یونیزاسیون درشت مولکول ها جلوگیری شود، در غیر این صورت در اثر رقیق شدن محلول ممکن است تغییراتی در شکل پلیمر صورت گیرد.

وزن مولکولی پلی ساکاریدها، لاستیک و لیگنین از این روش اندازه گیری شده است. همچنین پروتئین ها میتوانند با این روش مورد بررسی قرار گیرند. به شرطی که ابتدا ساختار طبیعی سه بعدی پروتئین های کروی تخریب شود. اندازه های اسیدهای ریبونوکلئیک و دئوکسی ریبونوکلئیک با اندازه گیری ویسکوزیته مشخص شده است، اما اگر اسید دئوکسی ریبونوکلئیک بزرگ باشد باید دقت کنیم زیرا نیروهای برشی که در ویسکومتر ایجاد شده ممکن است موجب تخریب درشت مولکولها شود.

وزن مولکولی برخی از پلیمرها، مثلا نوکلئیک اسید ها، با استفاده از ترکیبی از سرعت رسوبگذاری و ویسکومتری ، تخمین زده شده است. (ترکیبی از ضریب رسوب و ویسکوزیته باطنی برای استفاده نکردن از ضریب نفوذ مولکولی معادله مورد استفاده  بود که متغیرهای آن در بالا تعریف شده است ، و β’ ثابتیست که بر اساس شکل بیوپلیمر تعیین میشود.) با این حال، این روش مینای نظری مشخصی ندارد.

شکل 7-3- ویسکومتر آبلود اصلاح شده

3-3-5-سایر روش ها

تعدادی تکنیک دیگر نیز موجود است که برخی مخصوص یک پلیمر است. مهمترین آنها اینجا ذکر شده است.

3-3-5-1- الکتروفورز ژلی

الکتروفورز ژل (در حضور سدیم ددسیل سولفات (SDS)) فقط برای پروتئین ها استفاده می شود و برای تعیین وزن مولکولی زنجیره های پروتئین تکی مفید است.

در مواردی که زنجیره های یک مولکول توسط پیوندهای دی سولفید در کنار هم قرار گرفته اند (به بخش 4.2.3 ، مراجعه کنید)، ابتدا این پیوندها کاهش می یابد و ساختار سه بعدی اصلی مولکول ها از بین می رود. سپس مولکولهای SDS به هر زنجیره پروتئین متصل شده تا میله ای نسبتاً سفت و سخت ایجاد کند. اعتقاد بر این است که نسبت مقدار SDS به پروتئین موجود در میله برای پروتئین های مختلف، تقریبا ثابت است، یعنی هرچه مولکول پروتئین بزرگتر باشد، تعداد مولکول های SOS متصل به آن بیشتر می شوند. اعتقاد بر این است که گروههای سولفات SDS بر روی سطح کمپلکسی تشکیل داده و بار منفی کلی به آن می دهند.

کمپلکس پروتئین و SDS سپس در ژل پلی آکریل آمید تحت الکتروفورز قرار می گیرد (به بخش 2.3.2.2 مراجعه کنید) و فاصله یک پروتئین خاص نسبت به یک ماده نشانگر به اندازه میله پروتئین SDS بستگی دارد. به نوبه خود تابعی از وزن مولکولی زنجیره پروتئین است. برای ژل هایی که برای روش ژل تراوایی استفاده نمیشود، کمپلکس های پروتئین SDS باید از درون منافذ ژل حرکت کنند. بنابراین ، درشت مولکولهای کوچکتر آزادتر از انواع بزرگتر حرکت می کنند، در این مثال، پروتئین های کوچکتر مسافت بیشتری را حرکت میکنند.

کالیبراسیون با زنجیره های پروتئین با وزن مولکولی شناخته شده انجام میشود. کالیبراسیون نشان می دهد که مسافت طی شده در هنگام الکتروفورز به طور خطی با لگاریتم وزن مولکولی مرتبط است. بنابراین، با رسم نموداری فاصله حرکت کرده بر حسب log M ، نشان میدهد، پس از آنکه مسافت طی شده توسط آن بر روی الکتروفورز اندازه گیری شد، می توان وزن مولکولی یک زنجیره ناشناخته را پیدا کرد.

گلیکوپروتئین ها به دلیل اتصال کمتر به SDS نسبت به پروتئین های هم وزن، تمایل دارند مسافت های کمتری حرکت کنند. بنابراین باید یک گراف کالیبراسیون جداگانه برای گلیکوپروتئین ها ساخته شود.

اگر مولکول پروتئین از یک زنجیره واحد تشکیل شده باشد ، این روش وزن مولکول را مستقیماً می دهد. در جایی که یک مولکول از چندین زنجیره تشکیل شده باشد ، قبل از محاسبه وزن مولکول کامل ، باید تعداد زنجیره ها مشخص شود، زیرا تنها می توان وزن زنجیره های منفرد را از الکتروفورز یافت.

این کار به راحتی انجام میشود. تجهیزات مورد نیاز نسبتاً ساده است و فقط به مقادیر اندک (میکروگرم) پروتئین مورد نیاز است. با تغییر در تخلخل ژل های پلی آکریل آمید، دامنه های مختلف وزن مولکولی قابل بررسی است و این تکنیک در کل برای دامنه 12000-200000 مفید است. بنابراین ، این روش در حال حاضر یکی از رایج ترین روش هاست که برای اندازه گیری وزن مولکولی پروتئین استفاده میشود.

3-3-5-2-کروماتوگرافی ژل تراوایی

این روش برای انواع مختلفی از پلیمرها قابل استفاده است و در واقع پروتئین ها، پلی ساکاریدها ، اسیدهای نوکلئیک و لیگنین ها با این روش بررسی شده اند.

این روش شامل استفاده از ستونی از ژل های متخلخل یا لایه ای نازک از دانه های ژل بر روی تکیه گاهی بی اثر است (بخش 2.3.1.3 را مقایسه کنید).

اما این روش مطلق نیست و نیازمند کالیبراسیون با پلیمرهایی با وزن مولکولی شناخته شده که مشابه مولکول های طبیعی با ناشناخته  است، دارد.

در صورت استفاده از محلول پلیمر بر روی ستون ژلی، میزان مایع مورد نیاز برای شستشوی درشت مولکول ها از ستون به اندازه و شکل مولکول های پلیمر بستگی دارد. حجم شستشو برای نمونه مجهول (یا K_av به بخش 2.3.1.3 مراجعه کنید) با حجم شستشو (یا k_av) برای یک سری از درشت مولکول های شناخته شده مقایسه می شود. برای نتایج بهتر، درشت مولکولهای نمونه مجهول باید به همان شکل مولکولهای شناخته شده باشند. این نیاز همیشه براورده نمیشود و بنابراین باعث ایجاد عدم اطمینان میشود. به طور کلی، وزن مولکولی تعیین شده از این طریق دارای عدم اطمینان در حدود 10٪ است.

برای هر نوع پلیمری، به عنوان مثال، پروتئین های کروی، مشخص شده است که حجم شستشو (K_av⁾ با لگاریتم وزن مولکولی به طور خطی مرتبط است (به جز زمانیکه جرم مولکولی بالا و پایین پایین باشد که در صورت استفاده از تنها یک ژل با محدودیت مواجه هستیم). بنابراین می توان وزن مولکولی یک نمونه ناشناخته را از حجم شستشوی آن و این نوع نمودار کالیبراسیون پیدا کرد (شکل 3.8 را ببینید). برای هر ژل و هر نوع پلیمر مثل پروتئین های کروی، گلیکوپروتئین ها، اسیدهای نوکلئیک و غیره باید یک نمودار کالیبراسیون جداگانه تهیه شود.

از آنجا که پروتئین ها شکل های بسیار مختلفی دارند، ممکن است با کاهش پیوندهای دی سولفید در مولکول پروتئین، و تخریب کامل ساختار سه بعدی طبیعی (به عنوان مثال با کمک محلول کلرید گوانیدینیوم 6 مولار)، مقدار بهتری برای وزن مولکولی پروتئین بدست می آید. اگر روی پروتئین های استاندارد همین فرایند انجام شود، این فرض که همه درشت مولکول ها یک شکل دارند و آن شکل مارپیچ تصادفیست، فرض درستی است. با این حال ، اگر یک مولکول پروتئین از چندین زنجیره تشکیل شده باشد، این روش فقط وزن یک زنجیره را می دهد.

اگر یک نمونه پلی دیسپرس باشد ، می توان وزن مولکولی متوسط ​​را از حجم شستشو که در آن حداکثر مقدار پلیمر ضاهر میشود، بدست آورد. این میانگین معمولاً بین مقدار متوسط عددی و متوسط وزنی است.

استفاده از لایه نازک ژل نسبت به ستون ژل برتری هایی دارد. بسیار سریع است مقادیر  بسیار کمتری از پلیمر نیاز است. باز مسافتی که پلیمر روی ژل طی میکند، به اندازه و شکل ماکرومولکول بستگی دارد. در این روش، مسافت های منتقل شده توسط پلیمرها روی صفحه ژل به طور خطی با لگاریتم وزن مولکولی، که برای یک سری از درشت مولکول ها با شکل مشابه بدست آمده، مرتبط است. بنابراین وزن یک نمونه مجهول از مسافتی که روی ژل حرکت می کند و با کمک نمودار کالیبراسیون مناسب مشخص میشود.

به طور کلی تکنیک های نفوذ ژل برای تعیین وزن مولکولی بسیار مفید هستند، زیرا سریع و ساده هستند. اگر استانداردهای لازم برای کالیبراسیون فراهم شود، این روش ممکن است برای وزن ها در محدوده 1000 تا چند میلیون مورد استفاده قرار گیرد. یک مزیت دیگر این است که پلیمر مورد مطالعه نباید کاملاً خالص باشد. تا زمانی که روشی مخصوص برای تشخیص پلیمر نمونه موجود باشد، در صورت عدم آلودگی، می توان وزن مولکولی آن را بدست آورد. هرچه روش تشخیص حساس تر باشد، برای تعیین وزن مولکولی به پلیمر کمتری نیاز است. در نتیجه، وقتی که مقادیر کمی از یک پلیمر طبیعی در دسترس باشد، این روش کار آمد خواهد بود.

اتصال و تفکیک بیوپلیمرها نیز ممکن است توسط روش ژل تراوایی بررسی شود.

شکل 3-8- تعیین وزن مولکولی با کروماتوگرافی ژل تراوایی الف) نمودار بدست آمده از دستگاه ژل تراوایی با تطابق شناساگر و ثبت کننده که X و Y و Z استاندارهایی از یک نوع پلیمر با جرم مولکولی مشخص 60000 و 18000 و 10000 هستند. ب) منحنی کالیبراسیون logM=4,5 و M=31600

3-5-3-روش های شیمیایی:

این روش، بر مبنای تمام مونومرهای سازنده و گروه های درشت مولکولی سنجش کمی انجام میدهد.

اگر جز هر مونومر در پلیمر را بدانیم، و فرض کنیم هر درشت مولکول شامل کمترین مقدار از حداقل یکی از مونومرهای باقی مانده باشد، حداقل وزن مولکولی به راحتی با جمع کردن سهم هر یک از باقی مانده ها با جرم مولکولی بدست می آید. (یعنی مجموع وزن مولکولی باقی مانده، y، تقسیم بر تعداد مولکول های مونومر باقی مانده، y، در درشت مولکول) در جایی که ساختار کامل شناخته شده است، بمثلا پروتئین پس از تجزیه و تحلیل اشعه ایکس (به بخش 3.6 مراجعه کنید) ، وزن مولکولی با اضافه کردن وزن مولکولی کلیه باقیمانده های مونومرهای موجود در آن، محاسبه می شود.

در مواردی که یک مولکول پلیمر حاوی یک گروه خاص باشد، می توان وزن مولکول را با سنجش این گروه تعیین کرد، مشروط بر اینکه تعداد این گروه ها در هر مولکول مشخص شود. به عنوان مثال ، مشخص شده است که پروتئین میوگلوبین، حاوی یک اتم آهن در هر مولکول است و این آهن 0.335٪ وزن کل ماکرومولکول ها را تشکیل می دهد. بنابراین ما 0.335 گرم آهن یا  گرم اتم آهن در 100 گرم پروتئین داریم. از آنجا که در هر مولکول پروتئین یک اتم آهن وجود دارد ، بنابراین باید  مول پروتئین در 100 گرم موجود باشد، یعنی وزن مولکولی میوگلوبین  گرم است. به طور کلی، اگر در هر ماکرومولکول n گروه عاملی وجود داشته باشد و نیاز به R مول معرف برای واکنش با وزن w از پلیمری داشته باشیم، وزن مولکولی پلیمر،M ، از رابطه زیر بدست می آید:

3-26                                                                                                               

درشت مولکول ها معمولا یک گروه در انتهای زنجیر پلیمر، یک گروه آزاد قابل سنجش دارند. وزن مولکولی بر اساس گروه های انتهایی سنجیده میشود. به عنوان مثال، بسیاری از پلی ساکاریدها حاوی یک گروه کاهش دهنده در انتهای زنجیره هستند و میتواند به صورت کمی اندازه گیری شود. اسیدهای نوکلئیک اغلب فقط در یک طرف انتهای زنجیره پلیمر، دارای یک گروه فسفات هستند و بنابراین می توان وزن مولکولی را از سنجش این گروه فسفات تعیین کرد. روش سنجش، باید یک واکنش کامل با گروه عاملی باشد. این واکنش باید بدون واکنش جانبی باشد و پلیمر را تخریب نکند. هرچه پلیمر بزرگتر باشد، تعیین دقیق گروه های نهایی دشوارتر است، بنابراین از این روش نمی توان برای پلیمرهای بزرگ با وزن مولکولی بالای 10⁵ استفاده کرد.

از آنجا که این روش، تعداد مولکولهای موثر موجود در محلول را شمارش می کنند، برای نمونه های پلی دیسپرس متوسط عددی وزن مولکولی بدست می آید.

3-4-بدست آوردن توزیع وزن مولکولی

پلیمرهایی مانند پلی ساکاریدها، لیگنین، لاستیک و گوتا پرشیا معمولاً پلی دیسپرس هستند و بنابراین، برای توصیف کامل نمونه، باید توزیع وزن مولکولی بررسی شود.

یکی از اولین روشهای مطالعه توزیع وزن مولکولی، تقسیم نمونه پلی دیسپرس به تعداد زیادی  قسمت با توزیع وزن مولکولی باریک و مطالعه این بخش است. در اثر افزودن یک ضد حلال به محلول پلیمری، پلیمر در غلظت های مختلف ضد حلال ته نشین میشود. بنابراین میتوان این قسمت ها را با کمک اختلاف در انحلال پذیری از یک پلیمر جدا کرد. پلیمر های بزرگ نسبت به پلیمرهای کوچک، انحلال پذیری کمتری دارند. بنابراین اولین جز جدا شده، بیشترین جرم مولکولی را دارد و اجزایی که بعد از آن جدا میشوند، جرم های کمتری دارند. هر قسمت جدا شده و وزن میشود. حالا میتوان نموداری که نشان دهنده ی مقدار پلیمر به ازای هر جرم مولکولیست را بدست آورد. (شکل 3-9 را ببینید.) این روش زمان بر و خسته کننده است.

روش کروماتوگرافی ژل تراوایی، یک روش مستقیم است.(به بخش قبلی مراجعه کنید) اگر از یک ستون کالیبره شده استفاده شود، توزیع وزن مولکولی را می توان از وزن پلیمری که در هر لوله بدست می آید، تخمین زد. در هر سلول رقیق سازی، درشت مولکول ها با اندازه مشخص و همچنین کوچک مولکول هایی به خاطر پدیده ی نفوذ، ستون را ترک میکنند. این اتفاق موجب خطایی به خاطر نفوذ مولکولی میشود. در بسیاری از موارد، خطا در توزیع کلی زیاد نیست؛ زیرا خطای ناشی از نفوذ تقریباً برای همه لوله های نمونه یکسان است. تجهیزات تجاری در حال حاضر موجود است که توزیع مولکولی را مستقیم اندازه میگیرند.

اگر توزیع وزن مولکولی بسیار گسترده باشد، ممکن است با مشکل روبرو شوید. بنابراین ممکن است یک ژل نتواند کوچکترین و بزرگترین مولکول های یک پلیمر بسیار پلی دیسپرس را از هم جدا کند.

توزیع وزن مولکولی ممکن است با استفاده از اولتراسانتریفیوژ نیز مورد بررسی قرار گیرد، اما محاسبات بدون استفاده از کامپیوتر پیچیده و وقت گیر است.

عکسهای به دست آمده از سرعت ته نشینی (شکل 3-5 د، هـ، و) را می توان برای توزیع ضریب ته نشینی مشاهده شده تجزیه و تحلیل کرد. این فرایند با کمک معادله ی زیر انجام میشود:

3-27                                                                                       

که در آن g(s) مقدار پلیمری است که دارای اندازه ضریب رسوب گذاری در فاصله معین است، w سرعت چرخش است ، t زمان شروع کار است، x_m فاصله هلاله محلول از محور چرخش ، c₀ غلظت محلول اصلی است، x فاصله سلول از محور چرخش است و dc/dx گرادیان غلظت در موقعیت x داخل سلول است.

شکل 3-9- یک منحنی توزیع وزن مولکولی معمولی برای یک پلیمر طبیعی. در مقادیر بالاتر توزیع نامتقارن است.

معادله (3.27) توزیع مشخصی میدهد، که باید اصلاحاتی روی آن برای عواملی مثل نفوذ مولکولی و اثرات غلظت و فشار (در صورت وجود) انجام شود. تأثیر فشار ممکن است کم باشد، اما در غیر اینصورت، توزیع باید در سرعت های مختلف چرخش مورد بررسی قرار گیرد و تا سرعت برون یابی شود. در زمان نا محدود، پخش شدن مرز محلول و حلال در اثر نفوذ در مقایسه با پخش شدن به دلیل پلی دیسپرسیتی ناچیز است. بنابراین خطاهای توزیع ناشی از نفوذ مولکولی را میتوان با برونیابی تا زمان بینهایت به حداقل رساند. این اصلاح به طور معمول با نمودار g(S) ، برای هر مقدار S بر حسب 1/t، انجام شده و نمودار تا 1/t=0 برونیابی میشود. برای مولکول های بسیار بزرگ مانند اسیدهای نوکلئیک بزرگ میزان نفوذ بسیار اندک است، و لزومی به این اصلاح نیست.

سرانجام توزیع باید در  برای تعدادی از غلظت های پلیمر بررسی شود و هر g(S) به غلظت صفر پلیمر برونیابی شود. اگر غلظت بسیار کم پلیمر با جذب نور استفاده شود، از این اصلاحات صرف نظر میشود.

توزیع ضریب ته نشینی اصلاح شده می تواند به توزیع وزن مولکولی با کمک معادله 3-16 مرتبط باشد. اگر تأثیر اندازه بر D یا V مشخص نباشد، این فرایند دشوار خواهد بود.

ته نشینی تعادلی در اولتراسانتریفیوژ نیز ممکن است اطلاعات مربوط به توزیع وزن مولکولی را ارائه دهد. توزیع غلظت در کل سلول با توزیع اندازه مرتبط است، اما محاسبات مورد نیاز برای تصحیح اثرات نفوذ، فشار و غلظت ممکن است بسیار پیچیده باشد و به کمک یک کامپیوتر به بهترین شیوه انجام شود.

3-5-شکل مولکولی در محلول

فرایند حل کردن یک پلیمر در محلول به اندازه ی کوچک مولکول ها ساده نیست. انحلال در دو مرحله صورت می گیرد. ابتدا پلیمر جامد، مایع را جذب کرده و متورم میشود تا یک ژل تشکیل دهد. که در آن قسمت هایی از درشت مولکول ها در تماس هستند. ساختار بدست آمده، ساختاری سست است که حلال میتواند آزادانه در آن حرکت کند. سپس افزودن بیشتر یک حلال خوب قسمت های در تماس های پلیمر پلیمر باقی مانده را میشکند. سپس هر مولکول پلیمری حل شده و توسط لایه ای از مولکول های حلال احاطه می شود.در این حالت ژل به محلول تبدیل میشود.

برای بسیاری از پلیمرهای طبیعی ، یعنی پروتئین ها، پلی ساکاریدها و اسیدهای نوکلئیک، محلول های آبی بسیار مهم هستند و بنابراین، میتوان آب را یک حلال مناسب برای آنها دانست.

شکل 3-10- پیوند هیدروژنی در آب. این شکل مسطح بیانگر آرایش چهاروجهی است. پیوند های 3 و 4 روی صفحه و پیوند ها 1 و 2 به ترتیب رو و پشت صفحه هستند.

به دلیل وضعیت الکترونها، مولکول آب توانایی تشکیل حداکثر چهار پیوند هیدروژن را دارد. یکی سری از آنها مربوط به هر اتم هیدروژن و سری دیگر دو عدد جفت الکترون ناپیوندی روی اکسیژن است.(شکل 3.10 را ببینید) در واقع ، چنین آرایشی، پایه و اساس ساختار سه بعدی یخ را ایجاد میکند. به نظر می آید که بخش زیادی از این نظم در آب مایع حفظ شود. ساختار دقیق آب مایع ناشناخته است، اما احتمالا مناطق بسیار منظمی در ان وجود دارد، که در آن بسیاری از مولکول ها با پیوند هیدروژنی به هم پیوند خورده اند، و همچنین مناطقی از مولکولهای تنها و بدون پیوند وجود دارد. مناطق مرتب شده عمر کوتاهی دارند(میانگین عمر آنها 10 ثانیه است)، اما بطور مداوم در حال شکل گیری و اصلاح هستند. وقتی املاح به آب اضافه می شود، ترتیب مناطق مرتب و بی نظم تغییر می یابد.

به طور کلی ، پلیمرهای یونی و قطبی به راحتی در آب حل می شوند، زیرا بار های جزیی مولکولی آب با بار های پلیمر برهمکنش خوبی ایجاد میکند. به عبارت دیگر میتوانند پیوند هیدروژنی ایجاد کنند. درشت مولکول های غیر قطبی به جای مولکول های آب با یکدیگربر همکنش دارند، بنابراین به سختی در محلول آبی، حل میشوند. همجنین گروه های غیر قطبی پلیمرهای محلول تمایل به برهمکنش با یکدیگر دارند و نه با آب، زیرا قرار گرفتن آنها در کنار حلال آب باعث کاهش اثر نامطلوب کاهش انتروپی، میشود.

بحث در مورد شکل پلیمر در حالت محلول دشوار است. مولکول های پلیمر میتوانند حول بسیاری از پیوند های یگانه در زنجیر پلیمر بچرخند. بنابراین بسیاری از پلیمر ها میتوانند صورتبندی های مختلفی در هنگام حل شدن در یک مایع داشته باشند. بنابراین یک مولکول پلیمر حل شده یک شکل ثابت و ایستا ندارد، اما می تواند دائما تغییر شکل بدهد. بنابراین، اندازه گیری ما فقط یک شکل میانگین ​​است. در یک حالت حدی، ممکن است یک مولکول کاملا کشیده شود و مدل میله ای و سحت را بوجود آورد. قسمت های کوتاه اسید نوکلئیک دو رشته ای می تواند اینگونه رفتار کند. با این حال، یک زنجیره پلیمری خطی معمولا مانند یک قطعه درهم پیچیده رفتار میکند، که به آن مارپیچ تصادفی می گویند. به طور میانگین ​​، شکل این مار پیچ تصادفی یک کره است (شکل 3.11 را ببینید). در حلالهای "خوب" که برهمکنش پلیمر و حلال مناسب است، مولکول گسترده میشود، در حالی که در حلال های "بد" که در آن بر همکنش پلیمر پلیمر مناسب تر است، مولکول ها جمع می شوند (شکل 3.11 را ببینید) (همچنین به بخش 3.8 مراجعه کنید). پلیمرهای شاخه ای نسبت به پلیمرهای خطی در فضا کشیدگی کمتری دارند. احتمالا درشت مولکولهای بسیار شاخه ای ساختاری بسیار کروی و متراکم در حالت محلول دارند.

برای برخی از بیوپلیمرها، به عنوان مثال بسیاری از پروتئین های کروی، نیروهای سازنده ساختار سه بعدی مولکول ها، آنقدر قوی است که تعداد معدودی چرخش حول پیوندهای یگانه انجام میشود. در چنین پلیمرهایی، شکل مولکولی ایستا تر است و تنها تغییرات جزئی در ساختار صورت میگیرد. ممکن است این وضعیت در مورد اسیدهای ریبونوکلئیک کوچکتر نیز درست باشد.

اطلاعات مربوط به شکلهای مولکولی بیوپلیمرهای موجود در محلول را می توان با روشهای مختلفی بدست آورد. از جمله برخی از مواردی که در بالا برای تعیین وزن مولکولی شرح داده شده است.

شکل 3-11- شمای حالت مارپیچ تصادفی پلیمر، در حلال های مختلف

از اندازه گیری تفرق نور (به بخش 3.3.2 مراجعه کنید) جذر متوسط مریع (rms) شعاع ژیراسیون بدست می آید. (جذر متوسط وزنی r² در تمام عناصر جرمی پلیمر، که در آن r فاصله ی عنصر جرمی از مرکز جرم مولکول است.) با استفاده از این مقدار، شدت نور پخش شده به عنوان تابعی از زاویه پراکندگی می تواند محاسبه شود. محاسبات از نظر تئوری برای اشکال مولکولی خاص ، یعنی میله های سفت و سخت ، مارپیچ های تصادفی و کره های متراکم محاسبه شود. این شدتها با مقادیر بدست آمده به صورت تجربی از نمودار زیم (شکل 3.4) برای خط غلظت صفر مقایسه میشود. و شکل مولکولی بدست آمده از هر مدل نظری، شدت نزدیکی به مقادیر تجربی دارد. این نوع محاسبه برای پروتئین ها، پلی ساکاریدها و اسیدهای نوکلئیک انجام شده است.

بررسی ویسکوزیته نیز ممکن است اطلاعاتی در مورد شکل درست مولکولها بدهد. مقدار a (به معادله 3.23 مراجعه کنید) بستگی به شکل پلیمر در یک حلال خاص دارد. بنابراین به طور کلی، در یک حلال ضعیف که در آن مولکولهای پلیمری به عنوان کره متراکم رفتار می کنند a تقریبا برابر 0.5، و برای حالت مارپیچ تصادفی a حدود 0.75 و برای حالت میله ای a مقدار بیشتری دارد.

اندازه گیری ویسکوزیته برای بررسی تغییرات شکل بسیار مفید است. بنابراین ویسکوزیته یک پروتئین، پلی ساکارید یا محلول اسید نوکلئیک ممکن است در شرایط مختلف، به طور چشمگیری تغییر کند، به عنوان مثال، اگر شرایطی مثل pH یا دما، دچار تغییر شود، ساختار طبیعی مولکول از بین میرود.

تفرق نوری چرخشی (ORD) (تغییر چرخش نور قطبیده در اثر عبور از یک محلول) و رنگتابی دورانی (CD) (قطبیده شدن جزیی از نور دایره ای تابیده شده در اثر عبور از محلول) برای بررسی نوع و میزان ساختار دوم پروتئین ها، مورد مطالعه قرار گرفته است.(به بخش 4.4.2 مراجعه کنید). برای پلیمرهای مصنوعی طیف های ORD و CD با میزان تا شدگی مولکول مرتبط است.مدتی فرض بر این بود که مولکولهای پلیمرهای طبیعی (بخصوص پروتئینها) همین مدل تا شدگی را دارند، زیرا طیفهای مشابهی از آنها بدست میدهد. بر اساس همین شباهت طیف پلمیرهای طبیعی و مصنوعی، محاسباتی برای میزان تا شدگی انجام شد. اما امروزه مشخص شده که این مقادیر حدی، بر مبنای مدل های بسیار ساده است. برای مثال خم شدن در پروتئین ها نسبت به پروتئین های مصنوعی، بسیار پیچیده تر است. با این حال ، تغییر در پراکندگی چرخشی رنگتابی دورانی، برای نشان دادن تغییرات صورت بندی پلیمر، مناسب است. برای مثال از حالت فنری به مارپیچ تصادفی.

مطالعات رزونانس مغناطیس هسته ای (NMR)، برای بررسی پروتون و C¹³ به طور گسترده ای، برای درشت مولکول ها انجام میشود. با این حال، امروزه طیفهای پیچیده ای به دست آمده که تفسیر آنها بسیار دشوار است. با این وجود، تغییر در موقعیت محلی ماکرومولکول، مثل اتصال کوچک مولکول یا تغییر صورتبندی در اثر تغییر pH، قابل مطالعه است. همچنین گاهی اوقات پیوند هیدروژن درون و بین مولکولی را بررسی کرد.

3-6- شکل مولکول در حالت جامد

حرکت مولکولی در یک جامد محدودیت بسیار بیشتری نسبت به حالت یک مایع دارد. فقط برخی از لرزش های جزئی انجام میشود. از این رو ممکن است شکل یک مولکول پلیمر در جامد نزدیک به شکل واقعی ماکرومولکول باشد. بر خلاف زمانیکه برای پلیمر در حالت محلول شکل متوسط در نظر میگیریم.

ساده ترین راه برای تعیین شکل مولکول های پلیمری در حالت جامد، به صورت فرضی نگاه به مولکول های تکی در میکروسکوپ با بزرگنمایی مناسب است. در عمل، چنین میکروسکوپی باید با تابش الکترومغناطیسی از طول موج کوچکتر از مولکولهای مورد مطالعه ، یعنی طول موج های 1 انگشتروم (10^-10 متر) یا کمتر کار کند. این کار را می توان با میکروسکوپ الکترونی انجام داد. در این تجهیزات (شکل 3.12 را مشاهده کنید) الکترون ها می توانند با طول موج بین 0.5 تا 1 آنگستروم بتابند. پرتو الکترونی با استفاده از میدانهای مغناطیسی و الکتریکی روی نمونه متمرکز میشود. نمونه معمولاً با اسپری کردن محلول ماده مورد مطالعه بر روی توری و خشک کردن آن تحت خلا بدست می آید. مولکولهای نمونه الکترونهای تابیده شده را پراکنده می کنند. سپس دوباره روی صفحه فلورسنت متمرکز شده و به آن ضربه می زنند. سپس ممکن است تصویری از نمونه مشاهده شود. وضوح چنین ابزارهایی 5 تا 10 آنگستروم است، که میتواند درشت مولکولهای بزرگ و ساختارهای درون سلولی را نشان دهد، اما جزئیات ریز ساختاری مولکول، قابل تشخیص نیست.

اتم هایی با عدد اتمی بیشتر، تفرق بیشتری ایجاد میکنند. در عمل ، پراکندگی الکترونها به نوع اتمهای موجود در پلیمرها بستگی دارد. از آنجا که پلیمرهای بیولوژیکی بیشتر دارای اتمهایی با عدد اتمی پایین هستند، قدرت تفرق پایینی داشته و تصویر واضحی در میکروسکپ الکترونی نشان نمیدهد. این مولکولها ممکن است پس از قرار گرفتن در فرآیندی به نام "سایه زدن" با یک فلز سنگین، راحت تر قابل مشاهده باشند. طبق معمول نمونه ابتدا بر روی یک توری قرار می گیرد. سپس یک پرتو از اتم های فلزات سنگین مانند پلاتین یا پالادیوم از یک رشته گرم شده تبخیر شده و به صورت مورب در سطح نمونه قرار می گیرد. اتم های فلز سطح را میپوشانند، اما سایه ای نپوشیده شده ایجاد میکند. درشت مولکول زیر این قسمت است.(شکل 3.13 را ببینید). در تصویر بعدی روی صفحه فلورسنت (میکروگراف الکترونی)، ماکرومولول به دلیل تشکیل سایه در زمینه ای از الکترون های متفرق شده توسط یون های سنگین، قابل مشاهده است. برای مولکولهای بسیار بزرگ ، با بررسی میکروگرافهای الکترونی مناسب، می توان شکل و اندازه را تخمین زد. این روش برای مطالعه بیوپلیمرهای بزرگ مانند پروتئین های ساختاری، پلی ساکاریدها، و دیوکسی ریبونوکلئیک اسید و همچنین پلیمرهای معدنی مانند گرافیت استفاده شده است. مولکولهای بسیار بزرگ ممکن است هنگام خشک شدن نمونه بر روی توری قطعه قطعه شوند، که یکی از معایب این روش است. در مولکولهای بزرگ دی اکسی ریبونوکلئیک اسید، وزن در طول واحد مولکول، ثابت است. از این رو طول این مولکول ها قابل اندازه گیری است.

تصویر 3-12-شمای یک میکروسکپ الکترونی، میکروسکپ ها جدید لنز های بیشتری دارند.

تصویر 3-13- سایه زنی با فلزات سنگین در میکروسکپ الکترونی

همچنین شکل پلیمر ها به طور غیر مستقیم با استفاده از پراش پرتو X بدست می آید. در واقع، این تنها روش در حال حاضر برای تعیین ساختارهای سه بعدی ماکرومولکول ها با جزئیات زیاد است. در حالت کریستالی، مولکولهای یک ماده به طور منظم روی یک شبکه سه بعدی قرار می گیرند. شبکه از کنار هم قرار گرفتن واحد های تکراری سلول واحد بدست می آیند. از آنجا که قطرهای اتمی از نظر اندازه با طول موج اشعه X قابل مقایسه هستند، کریستال ها با آرایس معمول اتم ها در آنها، به عنوان سبکه متفرق کننده پرتو X عمل میکند. پرتوهای X تابیده شده توسط اتم های داخل کریستال پراکنده میشود. در بعضی جهات، پرتوهای پراکنده دچار تداخل شده و هیچ اشعه پراکنده ای شناسایی نمی شود، در حالی که در سایر جهات امواج یکدیگر را تقویت می کنند. آرایه ای از اتم ها را مانند شکل 3.14 در نظر بگیرید. تداخل سازنده اشعه X متفرق شده زمانی اتفاق می افتد که تفاوت طول مسیر پرتوهای پراکنده از لایه های پی در پی به اندازه ضرایب صحیح طول موج باشد. ممکن است این پرتوی روی یک صفحه عکاسی تشخیص داده شود. (تداخل سازنده هنگامی حاصل می شود که امواج متفرق شده کاملا در یک فاز باشند؛ هنگامی که امواج کاملا غیر همفاز می شوند، تداخل کاملا مخرب می شود.) برای پرتوهایی که با صفحه های اتمی را در زاویه θ برخورد می کنند، طول مسیر پرتو 2 به اندازه AB+BC بیش از مسیر طی شده توسط پرتو 1 است. (شکل 3.14). اگر فاصله بین صفحه ای d باشد، AB+BC=2dsin(θ) است. این تابع برای تمامی تداخل های سازنده به این صورت است:

3-28                                                                                                               

که در آن n یک عدد صحیح است و لاندا طول موج اشعه X است. این معادله به عنوان براگ برای پراش اشعه X شناخته شده است. [معادله (3.28) را می توان نوآرایی شود تا به λ=2d/n sin(θ) برسیم. بنابراین بازتاب های مرتبه بالاتر (n> 1) از صفحات با فاصله d می تواند به عنوان بازتاب های مرتبه اول از صفحات با فاصله d / n در نظر گرفته شود. معادله اساسی را می توان به عنوان λ= 2d sin θدر نظر گرفت.]

شکل 3-14- تداخل سازنده پرتوهای X

اگر یک تک بلور از یک ماده به اندازه کافی رشد کند و سپس در پرتوی اشعه ایکس چرخانده شود، (در مورد مثلاً محور تقارن بلور)  پرتوهای X متفرق شده ممکن است به صورت الگویی از لکه ها، در یک فیلم عکاسی که در پشت نمونه قرار گرفته است مشاهده شود. موقعیت لکه ها به صفحات مولکول های موجود در بلور و فاصله های بین صفحه ای مربوط میشود و توسط معادله برگ بدست می آید. از موقعیت لکه ها و اطلاعات تقارن بلور می توان اندازه و شکل سلول واحد کریستال را پیدا کرد. هنگامی که وزن مولکولی یک ماده مشخص است، می توان تعداد مولکولهای موجود در سلول واحد را از ابعاد سلول واحد و تراکم کریستال محاسبه کرد.

در جایی که تنها تعدادی بلورهای کوچک داشته باسیم، هنوز هم می توان الگوی پراش را مشاهده کرد. این الگو به صورت خطوطی روی صفحه عکاسی، به جای نقاط، دیده میشود. از این خطوط میکتوان اطلاعاتی از سلول واحد بدست آورد.

بسیاری از بیوپلیمرها در حالت جامد کاملاً کریستالی نیستند. پراش پرتو ایکس حاکی از تبلور موضعی است. یعنی قسمتی از چیدمان در حالت جامد مرتب است. در واقع پلیمرها از قسمت هایی مرتب در میان قسمت های نامنظم و آمورف تشکیل شده اند. به عنوان مثال، لاستیک کشید ، بسیار کریستالی تر از لاستیک کشیده نشده است، زیرا کشش موجب افزایش نظم چیدمان مولکول ها میشود. (به بخش 7.2.2).

الگوهای پراش خوبی را می توان از بسیاری از فیبرهای بیوپلیمری بدست آورد. این موضوع نشانگر وجود ترتیب و نظم در طول الیاف است. در حالی که ساختار در زاویه های عمود بر محور فیبر ممکن است بی نظم تر باشد. برخی از پلی ساکاریدها، پروتئین های ساختاری و اسیدهای دئوکسی ریبونوکلئیک طولانی به این روش مورد مطالعه قرار گرفته اند و میتوان اندازه واحد تکرار شونده در استخوان بندی پلیمر و فواصل بین زنجیره ای را بدست آورد. برای برخی از انواع بیوپلیمرها، این مطالعات حاکی از وجود ساختارهای سازمان یافته ای از قبیل مارپیچ یا صفحه های بتا است.(به بخش 4.4.2 مراجعه کنید)

حالت برخی از پلیمرهای طبیعی، به ویژه برخی پروتئینها، اسیدهای ریبونوکلئیک و پلیمرهای معدنی، بلوری است و تک کریستال های این مواد با استفاده از پرتوهای ایکس قابل مطالعه هستند. الگوهای پراش از نقاط تیز تشکیل شده و با تجزیه و تحلیل دقیق موقعیت و شدت این نقاط، می توان جزئیات ساختار سه بعدی مولکول های پلیمری را بدست آورد. قدرت اتم های هیدروژن برای پراکنده کردن پرتو X، بسیار کم است. بنابراین موقعیت اتمهای هیدروژن در درشت مولکول ها با این روش مشخص نمیشود. موقعیت اتم هیدروژن معمولاً از اطلاعات هندسی مونومرهایی که یک پلیمر را تشکیل می دهند، تعیین میشود.

شدت یک نقطه در الگوی پراش، به تعداد صغحات مرتبط به یک نقطه (ممکن است صفحات زیادی با فاصله ی d در کریستال وجود داشته باشد، به معادله 3-28 رجوع کنید) و توزیع اتم ها در مولکول پلیمر و قدرت پراکندگی (قدرت پراکندگی یک اتم متناسب با الکترون های آن است) آنها بستگی دارد، که میتوان گفت به زاویه پراش بستگی دارد. (شکل 3.14 و معادله 3.28)

اگر موقعیت های اتم ها در داخل یک مولکول و ترتیب مولکول درون یک بلور مشخص باشد، می توان الگوی پراش اشعه X را پیش بینی کرد. اما اگر الگوی پراش شناخته شده باشد، آیا  می توان از ساختار مولکولی را بدست آورد؟ این روند معکوس دشوار است. در گذشته، هنگامی که کریستالوگرافی اشعه ایکس به مولکول های کوچک و نسبتاً ساده محدود می شد، ساختار با حدس و خطا بدست می آمد. یک ساختار در نظر گرفته شده و الگوی پراش پیش بینی میشد. این سپس با الگوی تجربی مقایسه شده و ساختار فرض شده تغییر پیدا میکرد تا اختلافات با پراش مشاهده شده به حداقل برسد. این روش خسته کننده و وقت گیر بود و نمی توان از آن برای مولکول های پیچیده مانند پروتئین ها استفاده کرد.

همانطور که گفته شد، شدت یک نقطه در الگوی پراش بستگی به زاویه پراکندگی و تعداد صفحه های مرتبط به آن نقطه است. هر دو عامل را می توان در نظر گرفت، به طوری که می توان شدت را تنها به اصلاح با فاکتور ساختار مرتبط دانست. این فاکتور خود تابعی از موقعیت اتمی و قدرت پراکندگی است. شدت پرتوهای X پراکنده شده از یک مجموعه صفحه (برای تعیین یک نقطه) تحت تأثیر موقعیت اتمهای درون مولکول هاست، زیرا اگر اتمی کمی خارج از صفحه باشد، پرتوهای X پراکنده را کمی خارج از فاز  صفحه پراکنده می کند. این پرتوهای خارج از فاز باعث ایجاد برخی تداخلات ویرانگر می شوند و بنابراین شدت نقطه پراش را کاهش می دهند. [موقعیت های دقیق اتم ها در یک بلور به طور مستقیم از الگوهای پراش پرتو X به دست نمی آید. هرچند، تابع پیوسته، ρ(x,y,z) محاسبه میشود. محاسبه می شود این تابع چگالی الکترون در هر موقعیت (x,y,z) در کریستال را میدهد. با این تابع می توان موقعیت اتم ها را مشخص کرد، زیرا مناطقی که تراکم الکترونی بالایی دارند، بیانگر حضور اتم ها هستند. تابع ρ(x,y,z) با رابطه زیر بدست می آید:

که در آن F دامنه یک موج پرتو X پراکنده شده است. مقدار آن را می توان از جذر شدت نقطه پراش مربوطه یافت. h، k و l اعداد صحیحی هستند که صفحات را در سلول واحد تعریف می کنند - هر نقطه پراش به مقادیر منحصر به فرد h، k و l مرتبط است. α فاز است که در حال حاضر به طور مستقیم قابل تعیین نیست. بنابراین حتی با آگاهی از مقادیر h ، k و l و شدت نقطه پراش ، ρ(x,y,z) قابل محاسبه نیستند مگر اینکه یک مقدار تخمینی از α مشخص شود.] این تفاوت فازی باید قبل از تعیین ساختار مولکولی با کریستالوگرافی پرتو X، شناخته شود. دقیقاً بدست آوردن این اختلافات فازی است که سبب پیچیدگی و وقت گیر بودن تعیین ساختار مولکولی میشود.

اطلاعات مربوط به اختلاف فاز با روشی به نام جایگزینی ایزومورفوس (isomorphous replacement) بدست می آید. ابتدا، یک الگوی پراش پرتو X از کریستال، مثلاً یک پروتئین کروی بدست می آید. سپس مشتقی از این پروتئین تهیه می شود. این مشتق شامل یک اتم فلز سنگین است. این اتم در موقعیتی قرار میگیرد که بینظمی مولکول حداقل شود. اگر بتوان تک بلور بزرگی از این ترکیب بدست آورد، به طور معمول اندازه و تقارن سلول واحد مشابه بلور پروتئین اصلی است. الگوی پراش پرتو X از مشتق با الگوی اصلی مقایسه میشود. اختلافات بین این دو به دلیل وجود اتم های سنگین است. از این اختلافات می توان اطلاعاتی درباره اختلاف فازی بدست آورد. برای ارزیابی کلیه اختلاف های فازی، به چندین مشتق پلیمری نیاز داریم که هر یک حاوی یون فلزی سنگین متفاوتی است. برخی فرضیه ها در مورد ساختار درشت مولکولی ایجاد شده و ساختار نهایی به دست آمده با با استفاده از روش حدس و خطا اصلاح میشود، تا اختلافات بین الگوهای پراش پیش بینی شده و تجربی به حداقل برسد.

3-7- خواندنی های بیشتر

3-8- پیوست: مولکول پلیمر در محلول

تعریف اندازه پلیمر: یکی از شیوه های توصیف اندازه یک پلیمر، محاسبه فاصله ( ) ین دو انتهای زنجیره است. اما از آنجا که ممکن است صورتبندی یک پلیمر در محلول در حال تغییر باشد، این فاصله میتواند همواره در حال تغییر باشد. خوشبختانه ، این تغییرات کاملا تصادفی است که ما را قادر می سازد  میانگین فاصله بین دو انتهای زنجیره ( )را محاسبه کنیم. در حقیقت (همانطور که در پایین آورده شده است) محاسبه نظری فاصله میانگین را نشان نمی دهد، بلکه در عوض میانگین مربع بین دو انتها را نشان میدهد. ( ) سپس از جذر این مقدار ( ) برای بیان اندازه ی پلیمر استفاده میکنیم. این مقدار به عنوان جذر متوسط مربع (rms) در انتها شناخته میشود. تفاوت بین میانگین و جذر متوسط مربع با مثال زیر به خوبی مشخص میشود. میانگین 3 ، 5 و 7 برابر 5 است؛ میانگین مربعات  و جذر متوسط مربع  بوده که برابر 5.26 است.

یک مدل نظری برای مولکول پلیمر: تصور یک مولکول پلیمری نخ مانند باید اصلاح شود این اصلاحات باید این موضوع را در نظر بگیرد که، در حالی که نخ در سرتاسر طول انعطاف پذیر است، پیوندهای منفرد در استخوان بندی پلیمر نمی توانند خم شوند. با این حال، چرخش حول پیوند اتفاق می افتد. بنابراین ممکن است مولکول پلیمر از تعدادی پیوند، n، تشکیل شده باید که طول هر کدام l است. با فرض اینکه جهت هر پیوند در فضا مستقل از پیوند های اطراف باشد، می توان ابعاد این، مارپیچ تصادفی یا آماری را محاسبه کرد.

ابعاد مارپیچ تصادفی یا آماری: مارپیچ آماری بر اساس مدل ریاضی "پرواز تصادفی" در سه بعد ساخته شده است. این مسئله میتواند در حالت مشابه دو بعدی، که به آن راه رفتن تصادفی یا مستانه میگویند، ساده تر حل شود.  فرض کنید ما از یک نقطه معین شروع می کنیم و n قدم با طول L را کاملاً تصادفی برمی داریم، حال از نقظه شروع چقدر فاصله داریم؟ ساده ترین حالت زمانی است که n=2 باشد در شکل 3.15 نشان داده شده است، جایی که OA اولین قدم است ، AB قدم دوم و θ زاویه OAB است. سپس فاصله از نقطه شروع (OB) میتواند از رابطه ی زیر بدست آید:

بدون دانستن مقدار θ، محاسبه طول OB غیرممکن است. با این حال فرض کنید که آزمایش بارها و بارها تکرار می شود، فاصله OB بعد از هر دو قدم اندازه گیری می شود. تمام مقادیر θ به اندازه ی هم ممکن است مشاهده شود. از آنجا که cos(θ+π)= -cos(θ)، جمع کل عبارات cos(θ) صفر خواهد بود. با استفاده از ، OB را نشان می دهیم:

این بدان معناست که میانگین زاویه ی قدم دوم بر اولی 90 درجه و قائم است، که پاسخی که کاملاً مشخص است.

برای حالت کلی تر n قدم، داریم:

در این حالت، محاسبه مجموع تمام زوایای بینابینی به جای زاویه ی بین مراحل پی در پی ساده تر است.(شکل 3-15 ب) با استدلال مشابه داریم  و

که نشان می دهد که میانگین مربع فاصله انتها تا انتهای پلیمر با تعداد پیوندها یا واحدهای ساختاری در زنجیره متناسب است. پرواز تصادفی با تعمیم این حالت به سه بعد بدست می آید و دوباره رابطه بدست می آید.

شکل 3-15- راه رفتن تصادفی برای الف) دو قدم، ب) 11 قدم

این مدل برای پلیمر در حالت محلول چقدر واقعی است؟ بدیهی است که n تعداد پیوند ها و l طول واحد ساختاری است. اما آیا میانگین گیری در مورد یک پلیمر واقعی کار درستی است؟ بله، برای واحد تشکیل دهنده بسیاری از پلیمر ها که حرکت ثابتی به خاطر چرخش حول پیوند ها دارند، درست است.

ممکن است علت استفاده از متوسط مربع فاصله دو انتها به جای میانگین فاصله ی دو انتهای پلیمر، در آغاز مشخص نباشد. در حقیقت مقدار میانگین دو انتها، برابر صفر است. پلیمر را به عنوان یک جرم شل مارپیچی با شکل کروی در نظر بگیرید. اگر مرکز این جرم را به عنوان مبدا مختصات سه بعدی در نظر بگیریم (مشابه مبدا مختصات دو بعدی که مشهور تر است) هم جهت مثبت و هم منفی خواهیم داشت. احتمال یافتن انتهای زنجیره در راستای مثبت و با فاصله معین از مبدا، دقیقاً برابر با یافتن آن در جهت مخالف (منفی) و با همان فاصلخ خواهد بود. بدین ترتیب مجموع تمام این احتمالات ، یعنی میانگین فاصله انتهای زنجیره، صفر است. با استفاده از مربع ها، علامت منفی از بین می روند و یک جواب محدود بدست می آید.

تأثیر زاویه پیوندی ثابت و چرخش با ممانعت: مدل بالا برای یک مولکول پلیمری بسیار ساده است و واقعی تر شدن آن باید اصلاحاتی انجام دهیم. در مولکول پلیمر واقعی زوایای بین پیوندهای متوالی به نوعی ثابت شده و جهت هر پیوند در فضا مستقل است پیوند های کناری خود است. به عنوان مثال، در پلی اتیلن استخوان بندی از اتم های کربن تشکیل شده که توسط پیوندهای تکی کووالانسی بهم متصل شده اند و دارای زاویه چهار وجهی یعنی 109 درجه هستند. در مدل واقعی پلیمر، هر چند چرخش آزاد حول هر پیوند آزاد است، زنجیر به گونه ای است که بین هر واحد زاویه ای ثابت (θ) وجود دارد. میانگین مربع فاصله دو انتها از رابطه زیر بدست می آید:

که برای n بزرگ و θ دور از صفر، قابل استفاده است. با این حال ، ، مشابه حالت زنجیر کاملا تصادفی، هنوز هم متناسب با n است.

یکی دیگر از نارسایی های این مدل ساده این است که زنجیره فرضی می تواند خودش را قطع کند، یعنی دو واحد ممکن است همزمان یک موقعیت را در فضا اشغال کنند. که در مورد پلیمر واقعی درست نیست. پلیمر واقعی به دلیل حجم محدود واحد سازنده اش، قادر به پذیرش کلیه ساختارهای نظری نیست و از آن مستثنی است. بنابراین مفهومی به نام حجم مسثنی بوجود آمد تا ابعاد مولکولهای پلیمری واقعی  از یک مدل تصادفی معادل  توسط فاکتور انبساط ،α، به صورت زیر بیان کند:

تأثیر حلال: اکنون باید اثر حلال را بر اندازه پلیمر در نظر بگیریم. دلیل حل شدن درشت مولکول ارجحیت برهمکنش بین مولکول های پلیمر حلال نسبت به پلیمر پلیمر یا حلال حلال است. نظریه فوق شامل این فرضیه است که احتمال حضور کانفورماسیون های مختلف با هم برابر است. در واقع این بدان معنی است که هیچ تغییری در انرژی درشت مولکول در اثر حل شدن ایجاد نمی شود، یعنی دمای حلال ثابت می ماند که بسیار غیر معمول است. برای حل شدن اکثر پلیمر ها به انرژی نیاز داریم. زمانی که بر همکنش پلیمر حلال ارجح تر است، حلال خوب داریم. بنابراین صورتبندی هایی که این تماس را بیشتر کنند، ترجیح داده میشود. برای مثال مولکول کشیده تر میشود. برعکس ، البته اگر تماس با پلیمر - پلیمر ترجیح داده شود، حلال "بد" باشد، مولکول منقبض می شود.

"ابعاد بی دست نخورده" یک پلیمر: اثرات حجم مستثنی و حلال را "نیروهای دوربرد" می نامند، زیرا آنها از برهمکنش، بین قسمت هایی ناشی میشوند که از هم دورند و در راستای طول زنجیرند. اما از طرفی با پیچش پلیمر آنها بهم نزدیک تر میشوند. این دو با رابطه ای تئوری به شکل زیر بهم مرتبط میشوند:

که در آن A ثابتیست که به سیستم پلیمر حلال مرتبط است، θ دارای بعد دما، T درجه حرارت و M وزن مولکولی پلیمر است. مهمترین پیامد این رابطه این است که برای یک پلیمر در یک حلال ضعیف، درجه حرارتی به نام تتا وجود دارد که در آن α=1 است. بنابراین، درشت مولکول منبسط نمیشود. زیرا اثر حجم مستئنی با اثر حلال (که برهمکنش پلیمر پلیمر ارجح تر است) خنثی میشود. در این حالت گفته میشود پلیمر صورتبندی دست نخورده دارد که ابعاد دست نخورده را توصیف میکند. که اندازه گیری ها در شرایط θ برای بسیاری از پلیمر ها انجام شد و مشخص شد مقدار  ثابت است. همان طور که توسط تئوری انتظار آن را داشتیم. اما تا حدودی بیشتر از حد انتظار هستند. این به دلیل تأثیر نیروهای "کوتاه برد " اضافی است. این نیروها در نتیجه چرخش پیوندهای درونی واحد سازنده است که به صورت جزئی ممانعت دارند. این موضوع باعث میشود درشت مولکول ها انعطاف پذیری کمتری داشته باشند، و بنابراین صورتبندی های کشیده تر را ترجیح دهند.

پلیمرهای شاخه دار در محلول: مدل فوق برای یک مولکول پلیمر خطی است. اگر پلیمر شاخه دار باشد، تعداد زیادی انتهای زنجیر وجود دارد و فاصله دو انتهای زنجیر معنای مشخصی ندارد. علاوه بر این ، یک پلیمر شاخه ای نسبت به یک پلیمر خطی با همان وزن مولکولی، کمتر در فضا گسترش می یابد. با بزرگتر شدن انشعاب ها، تعداد صورت بندی های احتمالی نیز کمتر می شود و شکل مارپیچ تصادفی با پلیمری که ساختار کروی نسبتاً متراکم دارد، جایگزین میشود. انحراف از رفتار ایده آل برای پلیمرهایی با شاخه های زیاد، معمولا ناچیز است.